Immunhistologie

Zuletzt aktualisiert am: 15.05.2014

Autor: Prof. Dr. med. Peter Altmeyer

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Definition

Die Immunhistologie ist eine Methode zur Darstellung zell- und gewebespezifischer Antigene (Proteine), nachdem sie in situ mit spezifischen Antikörpern markiert und somit visualisiert wurden. Der Begriff Immunhistologie umfasst die Bereiche Immunhistochemie und Immunfärbung.

Allgemeine Information

  • Der immunhistologische Nachweis von Antigenen beruht auf der hochspezifischen Affinität von Antikörperbindungsstellen zu bestimmten Proteinstrukturen der Antigene (sog. Antigen-Antikörper-Reaktion).
  • Methodik: Zunächst erfolgt die Aufbearbeitung des histologischen Gewebes, in dem das Protein nachgewiesen werden soll (mittels Fixierung, Einbettung, Lagerung und ggf. Vorbehandlung durch Reduzierung des Hintergrundes und Antigendemaskierung). Anschließend werden die gegen das Antigen gerichteten Primärantikörper mit dem Gewebe inkubiert. Idealerweise kommt es zu einer spezifischen und starken Bindung zwischen Antikörper und Epitop. Zur Visualisierung sind die verwendeten primären Antikörper entweder selbst mit einem Farbstoff oder Enzym konjugiert, das visualisiert werden kann oder werden über einen zweiten Inkubationsschritt mit einem farbstoff- bzw. enzymkonjugierten sekundären Antikörper markiert, der dann visualisiert werden kann. Von den als AK-gekoppelten Enzymen sind Peroxidasen besonders gut geeignet und werden in der Routine häufig verwendet.
  • Der visuelle Nachweis erfolgt durch Fluoreszenz und enzymatische Farbreaktionen. Ziel ist es, ein Signal am Ort des Epitops in ausreichender Stärke zu erkennen.
  • Hohe Spezifität und Affinität des Antikörpers ist erfoderlich, um Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen zu vermeiden.
  • Die Antigen-Antikörper-Reaktion ist u.a. abhängig von Temperatur, Konzentration, Inkubationszeit und dem optimalen Reaktionsmileu (pH-Wert, Salzkonzentrationen).
  • Direkter Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion: Zusammenführung des Proteins mit dem Antikörper, an dem ein Enzym (z.B. Meerettich-Peroxidase) oder Fluorochrom (z.B. FITC, Texas-Red) konjugiert ist. Es folgt die Bindung des Antikörper an das Antigen, nicht gebundene Antikörper werden abgespült. Anschließend wird ein Substrat angeboten, das unter Bildung eines Farbstoffs mit dem Enzym reagiert. Dieser Farbstoff bildet sich nur dort, wo die immunchemische Reaktion stattgefunden hat. Bei Fluorochrom-markierten Antikörpern erfolgt die Detektion direkt im Fluoreszenzmikroskop.
  • Indirekte Methode: Hier wird ein spezifischer Antikörper auf das zu untersuchende Gewebe aufgebracht. Anschließend wird ein 2. Antikörper aufgetragen, der sich gegen den ersten Antikörper richtet (sog. Sekundärantikörper). Dieser ist mit einem Enzym gekoppelt und löst die bekannte Farbentstehung aus. Die Reaktion wird dadurch visualisiert.
  • Bei geringen Mengen an Proteinen kann ein Tertiärantikörper zugegeben werden, der sich an den Sekundärantikörper koppelt. Dieser Schritt dient der Signalverstärkung.
  • Die indirekte Technik wird u.a. zum Nachweis von bereits gebundenen endogenen Antikörpern (z.B. Autoantikörper, antinukleäre Autoantikörper, ANCA, Antihautantikörper) angewendet.

Durchführung

Allgemeine Vorgehensweise bei der indirekten Methode:
  1. Fixierung der Gewebeschnitte (z.B. in Äthanol).
  2. Inkubation mit Wassterstoffperoxyd, um die Aktivität der endogeneen Peroxidase zu blockieren.
  3. Behandlung mit bestimmten Lösungsmitteln, um die Permeabilität der Zellmembranen zu erhöhen und somit das Andocken der Antikörper an die Epitope zu erleichtern.
  4. Reduktion unspezifischer Bindungen durch Inkubation in Puffersubstanzen.
  5. Inkubation der Gewebeschnitte (meist 60 Minuten) mit dem ersten Antikörper.
  6. Spülen der Gewebeschnitte nach der 1. Inkubation
  7. Anschließend Inkubation mit 2. Antikörper für weitere 60 Minuten.
  8. Dann Nachweisreaktion mit einem Substrat, das mit der Peroxidase konjugiert.
  9. Zur Visualisierung der Reaktion Überführung des behandelten Gewebes in eine Detektionslösung.
  10. Abschließend Überführung der behandelten Gewebeschnitte von der wässrigen in die organische Phase mittels einer Färbereihe.
  11. Schließlich Betrachtung der Farbreaktion unter dem Mikroskop.

Hinweis(e)

Häufig verwendete Enzyme und Substrate:
  • Für die Nachweisreaktion: DAB (3,3'-Diaminobenzidin, bildet ein braunes Endprodukt.
  • Horseradish peroxidase (Meerrettichperoxidase, HRP): Marker-Enzym, konjugiert mit dem Antikörper.

Literatur
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  1. Gambichler T et al. (2007) Immunohistology of amicrobial pustulosis of the folds. Clin Exp Dermatol 32: 155-158

Tabellen

Antigen

Erläuterungen/Zelluläre Reaktivität/Gewebespezifität

Aktin

Aktine sind Zytoskelettproteine, die in allen Eukaryonten vorkommen. Sie bilden neben den Mikrotubuli und den Intermediärfilamenten die dritte Gruppe von Zytoskelettproteinen. Aktinfilamente sind in der Evolution hoch konserviert. Zusammen mit anderen Proteinen (u.a. Myosin) vermitteln die Aktinfilamente Bewegungen. Aktin wird in allen Muskelzellen gefunden. Bei Tumoren, die sich von diesen Geweben ableiten, wird Aktin ebenfalls in fast allen Fällen gebildet. Dies betrifft in erster Linie Leiomyome, Leiomyosarkome und Rhabdomyosarkome. Mit Antikörpern, die zwischen glattmuskulärem und Muskel-spezifischem Aktin unterscheiden, können entsprechende Weichgewebstumoren weiter differenziert werden.

Applikation: IHC (P) (G)

Amyloid A

Amyloid A ist ein extrazellulär abgelagertes, unlösliches fibrilläres Glykoprotein, das gegenüber proteolytischem Abbau hoch widerstandsfähig ist und von dem Vorläuferprotein Serumamyloid A erzeugt wird. Amyloidose ist der Oberbegriff für eine Gruppe von Krankheiten, denen die extrazelluläre Ablagerung von fibrillären Proteinen mit einer als ß-Faltblätter bezeichneten, spezifischen biochemischen Struktur gemein ist.

Applikation: IHC (P) (G)

bcl-2

Das bcl-2-Gen wurde als potenzielles proto-Onkogen klassifiziert, da es an der 14;18 Translokation beteiligt ist. Hierfür sprechen auch nachgewiesene Homologien zu Epstein-Barr Virus Genbereichen. Die Expression des bcl-2-Proteins wurde bei Fällen von Lymphomen mit einer 14;18 Translokation nachgewiesen. Generell helfen positive Ergebnisse bei der Klassifizierung follikulärer Lymphome und verschiedener diffuser lymphoproliferativer Erkrankungen.

Applikation: IHC (P) (G)

B-Zell-Antigene

CD10, CD20, CD21, CD45RA, CD74, CDw75, CD79a, MB2, Kappa-/Lambda-Leichtketten

Applikation: IHC (P) (G)

CEA

Karzinoembryonales Antigen (carcinoembryonic antigen) ist ein stark glykosyliertes Protein mit einer relativen Molekülmasse von circa 180 kDa. CEA ist ein wichtiger Tumormarker kolorektaler und anderer Karzinome. Alle Mitglieder der CEA-Untergruppe sind zellmembrangebunden und zeigen ein kompliziertes Expressionsmuster in normalen und malignen Geweben. Ekkrine und apokrine Schweißdrüsen, Morbus Paget, gastrointestinale Karzinome, Mikrozystisches Adnexkarzinom. Talgdrüsen und Melanozyten (NZN und Melanom) können CEA exprimieren, vereinzelt sind Merkelzellkarzinome positiv.

Applikation: IHC (P) (G)

COX-2

Die Cyclooxygenase Enzyme COX-1 und COX-2 sind bei der Biosynthese von Prostaglandinen der Arachidonsäure von großer Bedeutung. COX-2 ist ein induzierbares Enzym, das für die Prostaglandinsynthese an der Entzündungsstelle verantwortlich ist. COX-2 scheint auch bei Karzinogenese-Prozessen beteiligt zu sein, denn spezifische COX-2-Inhibitoren haben Antitumor-Effekte gezeigt. Neben anderen Tumoren zeigen die meisten primären malignen Melanome eine Expression von COX-2 auf, während benigne Naevi und angrenzendes normales Epithel negativ sind.

Applikation: IHC (P) (G)

Epstein-Barr-Virus

Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein humanes Herpesvirus, das normalerweise mit einer weit verbreiteten asymptomatischen Infektion einhergeht. Mehr als 95% der erwachsenen Bevölkerung weltweit sind Träger dieses Virus. EBV-infizierte Zellen und Neoplasien zeigen meistens eines von drei verschiedenen Expressionsmustern der latenzassoziierten viralen Gene. In der Latenz des Typs I wird nur das EBV-kodierte Kern-Antigen. (EBNA-1) zusammen mit zwei kleinen polyadenylierten Kern-Ribonukleinsäuren (EBER 1 und 2) exprimiert, die in Burkitt-Lymphom auftreten. In der Latenz des Typs II werden noch drei weitere latente Membranproteine (LMP-1, -2A, -2B) exprimiert; diese werden in der Hodgkin-Krankheit und im Karzinom des Nasopharynx angetroffen. Die Latenz des Typs III tritt in lymphoproliferativen Erkrankungen in immungeschwächten Personen auf. EBV ist mit bestimmten Tumoren lymphoiden und epithelialen Ursprungs assoziiert, darunter Burkitt-Lymphom, Immunoblastenlymphom, T-Zell-Lymphom und Hodgkin-Krankheit. Die einzige Situation wo das volle Virus repliziert wird ist die Haarleukoplakie, welche oft bei AIDS-Patienten beobachtet wird.

Faktor VIII

Faktor VIII ist ein makromolekulärer Komplex, der aus einem gerinnungsfördernden Faktor und dem Protein Faktor-VIII-assoziierten Antigen (von-Willebrand-Faktor) besteht. Der von-Willebrand-Faktor spielt beim Blutgerinnungsmechanismus eine zentrale Rolle und bindet spezifisch an einen auf Thrombozyten vorliegenden Rezeptor. In pathologischem Gewebe weist Anti-Faktor-VIII-assoziiertes Antigen die Mehrheit bösartiger und gutartiger vaskulärer Tumore nach.

Applikation: IHC (P) (G)

gp 100

(Antikörperklon HMB45 ) Der Antikörperklon HMB45 färbt ein zytoplasmatisch lokalisiertes Antigen (gp100) in Melanozyten und melanozytären Tumoren an. Das Antigen repräsentiert eine Komponente der melanosomalen Oxidoreduktasen und ist somit Melanosomen-spezifisch. HMB-45 lässt sich in ca. 85% der malignen Melanome nachweisen. Nävi und ruhende Melanozyten sind in der Regel negativ.

Applikation: IHC (P) (G)

Intermediärfilamente

Intermediärfilamente (IF) liegen in fast allen Arten von Säugetierzellen vor. Der Name rührt daher, dass Intermediärfilamente in ihrer Größe mit einem Durchmesser von 10 Nanometern zwischen den Aktinfilamenten (7 nm) und den Mikrotubuli (25 nm) liegen. Intermediärfilamente bilden mit den Mikrotubuli und Actinfilamenten als sogenannte Mikrofilamente das Cytoskelett der Zelle. Es werden fünf Haupttypen unterschieden: Cytokeratine finden sich in Epithelzellen, Desmine in Muskelzellen, Neurofilamente in Neuronen, Gliafilamente in Astrozyten und Vimentin in Mesenchymzellen. Da die Verteilungsmuster des Gewebes in Neoplasmen hoch erhalten bleiben, kann die Färbung von Gewebeschnitten mit Antikörpern mit verschiedenen IF-Typen nützliche Information bei der Identifizierung verschiedener Tumore liefern.

Applikation: IHC (P) (G)

Cytokeratin

Positive Ergebnisse unterstützen bei der Klassifikation gesunder und neoplastischer Gewebe, die ihrer Herkunft nach Epithelien sind. Cytokeratine können auch in nicht-epithelialen Tumoren exprimiert sein, z.B. in epitheloidem Angiosarkom, Leiomyosarkom, epitheloidem Fibrosarkom. Cytokeratine können mit Vimentin und anderen Intermediärfilamenten koexprimiert werden, z.B. in Nierenzellkarzinom-Metastasen.

Applikation: IHC (P) (G)

Desmin

53 kDa schweres Intermediärfilament-Protein, das im Zytoplasma der Skelett- und Herzmuskelzellen ebenso wie in den meisten Zellen der glatten Muskeln vorliegt. Mittels Antikörper können Zellen von Tumoren myogener Herkunft, die ihren Ursprung in der glatten Muskulatur (Leiomyome von Uterus und Haut und einige gastri¬sche Leiomyosarkome), wie auch in der quergestreiften Muskulatur (alveoläre und embryonale Rhabdomyosarkome) detektiert werden.

Applikation: IHC (P) (G)

Neurofilament

Nervenzellen (Axone) des zentralen und peripheren Nervensystems bilden Neurofilament und können bei der Identifizierung von Tumoren mit neuronaler Differenzierung als Zielantigen hilfreich sein.

Applikation: IHC (P) (G)

Gliafaserprotein

Identifizierung von Astrozyten sowie von astrozytären Zellen bei normalen und krankhaften Zuständen.

Applikation: IHC (P) (G)

Vimentin

Vimentin ist das Zytoskelettprotein von mesenchymalen Zellen einschließlich Fibroblasten, Chondrozyten, Osteozyten, Endothelien und weißen Blutkörperchen. Es wird generell in Sarkomen gebildet und wird als übergeordneter Marker für Weichgewebstumoren eingesetzt. Allerdings zeigen auch entdifferenzierte Karzinome eine Expression von Vimentin, dann meist mit einer zumindest partiellen Koexpression von Zytokeratinen wie z. B. bei epitheloiden Sarkomen.

Applikation: IHC (P) (G)

Kappa-Leichtketten

Bei den Kappa-Leichtketten handelt es sich um Aminosäure-Polypeptid-Ketten mit je einer variablen und konstanten Domäne. Alle fünf Immunglobulinklassen weisen eine von zwei Immunglobulin-L-Ketten auf. Der zweite Leichtkettentyp wird Lambda genannt. In einer einzelnen Zelle wird immer nur ein L-Kettentyp, also entweder Lambda oder Kappa, produziert. In der normalen B-Zellen-Population gehören 60% der Immunglobuline zum Typ Kappa und die übrigen 40% zum Typ Lambda. Positive Ergebnisse tragen zur Klassifizierung von B-Zell-Lymphomen durch Nachweis ihrer Leichtkettenrestriktion bei.

Applikation: IHC (P) (G)

Ki 67 (MIB1)

Das Ki67-Antigen ist ein Proliferationsmarker, d.h. er färbt die Zellen im Gewebe an, die sich vermehren, die so genannte Wachstumfraktion. Während des Zellzyklus wird dieses Antigen in der G1-, in der S-, in der G2- und in der M-Phase exprimiert. Ru¬hende Zellen, also Zellen, die sich in der G0-Phase befinden, exprimieren das Ki67-Antigen nicht. Die Färbung für Ki67 gibt also mittelbar Aufschluss über die Wachstumsgeschwindigkeit eines Tumors und ist deshalb in der Routinediagnostik von unschätzbaren Wert. Aber auch in der Entscheidung zwischen benignen, präneoplastischen und malignen Veränderungen kann die Darstellung des Ki67-Antigen wertvolle Hilfestellungen geben.

Applikation: IHC (P) (G)

Kollagen IV

Collagen IV ist ein Hauptbestandteil der Basalmembran, insbesondere in den Wänden von Blutgefäßen, der Umgebung Schwann'scher Zellen und den meisten Epithelgeweben. Bei der angeborenen Epidermolysis bullosa lassen sich mittels Antikörpern beide Hauptvarianten (EB simplex und EB dystrophica) unterscheiden.

Applikation: IHC (P) (G)

Lambda-Leichtketten

Lambda leichte Ketten sind eine von zwei Aminosäurereste-Polypeptidketten, die in allen fünf Immunglobulinklassen vorliegen; die andere Art leichte Ketten ist vom Typ Kappa. Beim Menschen sind ungefähr 40% der leichten Ketten vom Lambdatyp und 60% vom Kappatyp. Jedes Immunglobulin weist nur einen Typ leichte Ketten auf.

Applikation: IHC (P) (G)

Laminin

Laminine sind große Basalmembran-Glykoproteine. Es sind zur Zeit 15 verschiedene Isoformen bekannt. Die Laminin-Isoformen befinden sich an verschiedenen Gewebe- und Entwicklungsstand-spezifischen Stellen. Laminine fördern Zelladhäsion, Migration, Protease-Aktivität, Proliferation, Tumorwachstum, Angiogenese und Metastasierung.

Applikation: IHC (P) (G)

Mastzell-Tryptase

Mastzell-Tryptasen bilden eine Familie Trypsin-ähnlicher, neutraler Serin-Proteasen, die überwiegend in Mastzellen exprimiert werden. Alle diese Stoffe sind wichtige Mediatoren, die an der Bronchokonstriktion und Überreaktion der Atemwege beteiligt sind, die wiederum einen bedeutenden Beitrag zu allergischen Erkrankungen der Atemwege leisten. Die Mastzellen-Degranulation und die folgende Freisetzung von Mastzell-Tryptase sowie Histaminen, Leukotrienen und Zytokinen in das umliegende Gewebe, stellt ein zentrales Ereignis einer entzündlichen Reaktion dar. Der Nachweis der Mastzell-Tryptase ist für die Identifizierung von äußerst atypischen, hypogranulierten oder sogar nicht metachromatischen Mastzellen, insbesondere bei der Mastzellenleukämie sowie für die Aufdeckung von kleinen Mastzell-Infiltraten von entscheidender Bedeutung.

Applikation: IHC (P) (G)

Melan-A

Das Melan-A-Antigen kodierende Gen ist 18 kb lang und wird nur in normalen Melanozyten sowie in den meisten Melanom-Tumoren exprimiert. Melan-A ist ein aus 118 Aminosäuren bestehendes Transmembranprotein unbekannter Funktion.

Applikation: IHC (P) (G)

Myeloperoxidase

Myeloperoxidase ist ein Hauptbestandteil der zytoplasmatischen primären (azurophilen) Granula neutrophiler myeloischer Zellen. Die Funktion der Myeloperoxidase und weiterer Enzyme in den primären Granula besteht in der Zersetzung von Mikroorganismen und Fremdkörpern innerhalb der Phagozytosevakuole der Zelle. Da primäre Granula in einem frühen Stadium der myeloischen Zelldifferenzierung auftreten und während der gesamten Reifung vorhanden sind, ist die Myeloperoxidase ein nützlicher Marker für den Nachweis myeloischer Zellen.

Applikation: IHC (P) (G)

p53

p53 ist ein Tumorsuppressorgan mit einem Molekulargewicht von 53 kD. Das Genprodukt ist nukleär lokalisiert und stellt ein zentrales Protein der Zellzykluskontrolle dar. Die zentrale Funktion von p53 ist es, Zellen, die genetische Schäden aufweisen, nicht mehr zur Vermehrung zuzulassen. Diese Zellen gehen dann durch Apoptose zugrunde. Wenn die Funktion von p53 durch eine Mutation im Gen eingeschränkt oder aufgehoben ist, können genetisch geschädigte Zellen nicht mehr aussortiert werden und so können sich im Laufe von mehreren Zellzyklen genetische Schäden anreichern. In normalen Geweben wird p53 nur in geringer Menge exprimiert. Wenn allerdings eine Punktmutation im p53-Gen vorhanden ist, die die Funktion des Proteins einschränkt, reichert sich das defekte Protein im Kern an, und kann dann immunhistologisch nachgewiesen werden. Punktmutationen des p53-Gen kommen in malignen Tumoren unterschiedlicher Histogenese sehr häufig vor. Verwertbar als Malignitätskriterium ist eine kräftige nukleäre Expression in nahezu allen Tumorzellen.

Applikation: IHC (P) (G)

S100

S100 stellt eine Gruppe von relativ kleinen Proteinen dar, die als gemeinsame Eigenschaft Kalzium-Ionen binden und dann in Abhängigkeit von der intrazellulären Kalzium-Konzentration andere Proteine aktivieren. S100-Proteine findet sich in Glia- und Ependymzellen des ZNS. Zudem sind Melanozyten sowie melanozytäre Tumoren S100-positiv. Bei malignen Melanomen findet sich meist auch dann noch eine S100-Positivität, wenn andere melanozytäre Marker auf Grund einer fortschreitenden Entdifferenzierung nicht mehr gebildet werden. Speicheldrüsentumoren und Tumoren der ekkrinen Schweißdrüsen zeigen häufig ebenfalls eine Expression von S100.

Applikation: IHC (P) (G)

T-Zell Antigene

CD3, CD4, CD5, CD8, CD43, CD45RO, CD45RA

Applikation: IHC (P) (G)

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